Extracção de DNA

Quarta-feira, 30 de Janeiro de 2008, lá ia eu para mais uma aula prática de Biologia.
O que nos esperava desta vez?? Extracção e analise de DNA de frutos. Para esta experiência o professor Salsa escolheu um kiwi e um morango.

Material necessário:

• Kiwi e morango
• Saco de congelar
• Bisturi
• Almofariz (na verdade foram 2 porque o 1º eu parti, sem querer claro :)).
• Balão de Erlenmeyer de 250ml
• Gobelé de 250ml
• Proveta de 100ml
• Tubo de ensaio
• Funil de vidro
• Vareta de vidro
• Vidro de relógio
• Pipeta de plástico
• Gase
• Cloreto de Sódio – 3g
• Detergente da louça – 10m
• Água destilada – 100ml
• Etanol a 95% frio (a 5°C)
• Fucsina básica
• MOC

Procedimentos:

A cada grupo foi dado um kiwi e um morango, com a ajuda do bisturi descasquei o kiwi e cortei-o em pedacinhos e removidas as sépalas ao morango.

Colocamos o kiwi em pedaços num saquinho de congelar, o morango noutro e esmagamos o s frutos com a ajuda de um almofariz (eu esmaguei o kiwi, até que parti o almofariz J) mas com cuidado para não rasgar os sacos, visto que queríamos recolher a parte da mistura que tivesse mais liquida.

Aquando isto, preparamos a solução de extracção de DNA, num balão de Erlenmeyer juntamos a água destilada, o sal e o detergente. Agitamos mas com cuidado para que não fizesse espuma, durante 5minutos.

Após isto, adicionamos esta solução á polpa de fruta no saco (primeiro foi no morango) e preparamos outra solução para o kiwi (que foi o que eu fiz). Após a adição em ambas as misturas, com a ajuda dos dedos continuamos o esmagamento e a mistura, durante 3minutos.

Filtramos 20ml do preparado para o Gobelé com a ajuda da gase que colocamos no funil de vidro.

Transferimos os 20 ml para uma proveta.

Cuidadosamente e fazendo escorregar pelas paredes da proveta adicionamos 20ml de etanol frio e podemos observar que este não se misturava com o anterior preparado (como a agua e o azeite) o etanol formava uma camada transparente por cima da mistura.

Deixamos repousar cerca de 15 minutos. Durante esse período conseguimos observar uma camada gelatinosa branca (o DNA) a subir no etanol até a superfície.

Retiramos uma amostra dessa camada gelatinosa para o vidro de relógio com a ajuda da vareta de vidro, adicionamos um corante para que fosse possível a observação ao microscópio (Fucsina básica) colocamos a amostra numa lâmina, depois a lamela e observamos ao MOC.

Discussão de resultados

Visto que o DNA no seu todo não se consegue observar ao MOC, o que conseguimos observar deste foi um conjunto de filamentos proteicos.
Uma vez que o detergente dissolve as membranas lipídicas além de desintegrar os núcleos e os cromossomas das células, liberta o DNA. Com a ruptura das membranas, o conteúdo celular, incluindo o DNA e proteínas, soltam-se, dispersando na solução.

A adição de sal, no inicio da experiencia proporciona ao DNA um ambiente favorável. O sal contribui com ínos positivos NA­+ que neutralizam a carga negativa do DNA. Dessa forma o DNA precipita na solução aquosa.

O álcool gelado, além de proporcionar uma mistura heterogenia (duas fases), em ambiente salino faz com que as moléculas se DNA se aglutinem, formando uma massa filamentosa e esbranquiçada.
Como o DNA não de dissolve no álcool nas concentrações e temperatura utilizada e é menos denso que a agua, este sobe pela fase alcoólica.